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　　鸡PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的克隆表达及多克隆抗体的制备.pdf

　　PD1（PROGRAMMEDCELLDEATH1）是免疫球蛋白超家族成员之一，最早在T细胞杂交瘤细胞凋亡调节研究中发现，AHMED及其同事在LCMV慢性感染小鼠模型中证实PD1是T细胞表面的一种抑制性受体。PD1与PDLS介导的信号通路对T细胞的免疫抑制性信号的激活，T细胞的增殖及平衡免疫过程介导的组织损伤起到重要地调节作用。PD1的配体有两种类型，分别为PDL1和PDL2。阻断PD1与其配体的结合可以使病毒持续性感染时功能障碍或衰竭的CD8T细胞功能恢复。由于PD1PDL1通路在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号，使得PD1及其配体PDL1成为近年来人们在慢性持续性病毒感染、免疫耐受性疾病、肿瘤等免疫抑制性疾病研究中关注的热点。目前，虽然已经证实鸡T细胞表面存在PD1分子，但对于PD1及PDL1分子在鸡等禽类动物病毒感染导致的免疫抑制性疾病或病毒持续性感染疾病中发挥的生物学功能和作用的相关研究才刚刚起步。本研究以鸡PD1及其配体PDL1的胞外区为研究对象，通过克隆、表达及纯化等技术，最终获得具有活性的鸡PD1及PDL1胞外区原核表达重组蛋白，以期进一步应用该基因表达产物制备特异性的单克隆抗体，为探索PD1和PDL1在禽类相关免疫抑制性疾病过程中发挥的生物学功能奠定研究基础。本研究根据GENBANK中鸡PD1和PDL1的基因序列，通过生物信息学比对分析及原核表达载体多克隆酶切位点，设计其胞外区引物，以鸡外周血单个核细胞（PBMC）的CDNA为模板，应用PCR技术扩增鸡PD1和PDL1胞外区片段。构建重组原核表达质粒PET28APD1和PET32APDL1，经双酶切和测序正确后转化至宿主菌ROSETTA（DE3）进行诱导表达。应用SDSPAGE和WESTERNBLOT方法分析重组蛋白的表达情况及表达形式，鉴定重组蛋白的抗原特异性。然后采用切胶回收和HIS镍柱亲和层析获得两种重组蛋白的纯化产物，并制备兔抗高免血清。分别利用ELISA和WESTERNBLOT方法来鉴定多抗血清的效价和免疫学活性。研究结果表明，成功扩增出鸡PD1和PDL1胞外区目的基因，并克隆至表达质粒PET28A和PET32A。经PCR、双酶切和测序结果比对分析未发生氨基酸突变现象，成功构建了原核重组表达载体PET28APD1和PET32APDL1。重组表达质粒转入ROSETTA宿主菌后经IPTG诱导，SDSPAGE分析显示，表达出与预期大小相一致的目的蛋白条带，其分子量分别为20KDA和44KDA，且两种重组蛋白均以包涵体形式存在。WESTERNBLOT鉴定结果显示，PD1和PDL1的胞外区重组蛋白分别能被HIS标签单抗所识别，二者均具有良好的反应原性。PD1和PDL1重组蛋白经纯化后，分别得到浓度为08MG/ML和15MG/ML重组目的蛋白。通过间接ELISA和WESTERNBLOT方法分析PD1和PDL1兔多抗血清的效价和免疫学活性，结果表明，PD1和PDL1多抗血清的效价可达到1102400，并且具有良好的免疫学活性。可为制备相应单抗，用于阻断PD1/PDL1信号通路，研究其在鸡免疫抑制病中的功能及作用奠定基础。

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